Larry Daley (Ben Stiller) já tinha conseguido se acostumar com a mudança que acontecia toda a noite no Museu de História Natual nos Estados Unidos. Ele já não tinha mais problemas quando todas as peças ganhavam vida à noite, devido à presença de uma placa de um faraó exposta no local.
Os itens expostos no museu guardado por Larry, porém, são transferidos para o museu Smithsonian, de Washington, o maior do mundo.
Prevendo o que vai acontecer, ele vai para o grande centro de cultura para controlar os seus antigos amigos e os já expostos no museu.
Al Capone, Amelia Earhart (Amy Adams), uma das pioneiras da aviação, e vários presidentes americanos ganham vida neste filme.
